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Intérêt de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF pour l'identification des champignons filamenteux

Mis à jour le 14/12/2012

M.-É. Bougnoux 1 , C. Lacroix 2 , N. Hassouni 1 , J.-L. Beretti 1 , B. Dauphin 1

1 Service de microbiologie, hôpital Necker Enfants Malades, APHP, 149 rue de Sèvres, 75015 Paris, France

2 Service de parasitologie-mycologie, hôpital Saint Louis, APHP, 75010 Paris, France

E-mail : marie-elisabeth.bougnoux@nck.aphp.fr

Date de la publication : Décembre 2011

 

Résumé :

L’identification des champignons filamenteux, moisissures et dermatophytes, repose actuellement sur l’étude morphologique macroscopique et microscopique des colonies et, par conséquence, sur l’expérience du mycologue. Cette approche longue et fastidieuse, souvent imprécise, est incompatible avec les exigences actuelles de diagnostic des infections fongiques. L’identification des champignons filamenteux par MALDI-TOF est un champ d’innovation en pleine expansion. Bien que très peu d’études soient encore disponibles, les premiers travaux ont montré que la spectrométrie de masse MALDI-TOF permet d’obtenir une identification précise des espèces de champignons filamenteux, y compris au sein des complexes d’espèces. La spectrométrie de masse MALDI-TOF représente ainsi le premier outil permettant une identification rapide, précise et standardisée des champignons filamenteux. Les bases de données actuellement disponibles doivent être désormais évaluées dans les différents laboratoires de mycologie cliniques et complétées afin d’élargir le spectre des espèces identifiées.
Mots-clés : MALDI-TOF-MS, champignons filamenteux, moisissures, dermatophytes, identification

 

Interest of MALDI-TOF mass spectrometry for the identification of filamentous fungi

 

Abstract:

Identification of filamentous fungi, molds and dermatophytes, is currently based on the morphological study of colonies and therefore the experience of the mycologist. These techniques are not sufficiently precise to distinguish between different species within the same section. Furthermore, identification can be delayed for several weeks due to subcultures on specific media. MALDI-TOF MS allows correct identification of filamentous fungi until the species level in more than 95% of cases in most studies. MALDI-TOF MS is a fast and precise identification technique for filamentous fungi; however most of the different databases need to be further evaluated in routine and completed to broaden the spectrum of species identified.
Keywords: MALDI-TOF-MS, filamentous fungi, molds, dermatophytes, identification

 

PARTICULARITÉS LIÉES AUX PROCÉDURES D’IDENTIFICATION DES ESPÈCES FONGIQUES

Schématiquement, les espèces fongiques à identifier dans les laboratoires de mycologie peuvent être séparées en deux groupes : les levures et les champignons filamenteux. Ce dernier groupe inclut les moisissures et des champignons filamenteux particuliers par leur tropisme pour les phanères qui sont rassemblés sous le terme générique de dermatophytes. Deux approches différentes sont mises en oeuvre pour l’identification de ces deux groupes de champignons. Alors que l’identification des levures est bien standardisée et parfois automatisée, l’identification des champignons filamenteux repose uniquement sur l’analyse des caractéristiques macroscopiques et microscopiques des colonies.

L’étude morphologique nécessite le développement optimal des colonies, c’est-à-dire une maturation suffisante de la culture pour que les colonies présentent un aspect typique et que les fructifications apparaissent. Ce délai de maturation varie selon chaque espèce fongique. Des repiquages sur milieux sélectifs sont souvent nécessaires pour l’obtention de fructifications, essentielles pour l’étude des caractéristiques microscopiques. Les milieux sélectifs proposés, tels que le milieu malt, PDA ( Potato Dextrose Agar), Czapeck ne sont pas commercialisés ; leur utilisation est dépendante de la possibilité qu’a chaque laboratoire de fabriquer lui-même ces milieux. Enfin, il n’existe pas de référentiel pour guider l’identification morphologique qui repose essentiellement sur l’expérience et la patience des mycologues. De ce fait, l’identification des champignons filamenteux fondée uniquement sur l’étude morphologique reste une étape délicate, longue et laborieuse, souvent imprécise, incompatible avec les exigences actuelles de diagnostic des infections fongiques. Le diagnostic des infections fongiques, élément clé pour une prise en charge optimale des patients infectés, doit être à la fois précoce et précis. En effet, il a été clairement démontré, d’une part, qu’un retard à l’administration d’un traitement antifongique, dû en partie à un délai diagnostique trop long, est associé à une augmentation significative de la mortalité et d’autre part, que la survie des patients augmente lorsqu’ils sont traités par un antifongique adéquat, c’est-à-dire dont le spectre d’activité est adapté à l’espèce responsable [1-4]. Or, les moisissures, qui représentent la majorité des champignons filamenteux responsables d’infections invasives, sont des microorganismes ubiquistes, dont le nombre d’espèces capables d’émerger comme pathogènes opportunistes chez les patients les plus immunodéprimés ne cesse d’augmenter.

Ceci est dû à la résultante de deux phénomènes distincts, l’un démographique et l’autre technique. Le premier correspond à l’augmentation de la population de patients – de plus en plus fragilisés, à risque de développer une infection fongique [5]. Les patients ayant une immunodépression congénitale survivent plus longtemps et sont donc plus nombreux. Les immunodépressions acquises ou iatrogènes sont en augmentation du fait des progrès thérapeutiques (greffe de moelle, immunosuppresseurs, anticorps monoclonaux dont les anti-TNF-alpha). Enfin, la prescription d’une antibiothérapie à large spectre s’est étendue à un nombre croissant de situations diminuant le nombre de décès précoces par infections bactériennes.

Le deuxième phénomène est la conséquence de l’introduction de méthodes de biologie moléculaire pour l’identification des champignons, ce qui a permis de décrire de nouveaux taxa et de redresser des identifications peu fiables. Parallèlement, l’essor récent de la phylogénie moléculaire a conduit à une révision de la taxonomie des champignons filamenteux. Ainsi, la notion de « complexe d’espèces » a émergé. Il est apparu que l’identification de nombreuses espèces d’importance médicale correspondait à une identification d’espèce au sens large, sensu lato, incluant plusieurs espèces partageant des caractéristiques phénotypiques très proches, voire superposables. Les complexes d’espèces incluent l’espèce sensu stricto, plus d’autres espèces récemment décrites et regroupées dans le complexe d’espèces. Par exemple, la nomenclature des Aspergillus et des Scedosporium, champignons filamenteux les plus souvent isolés en clinique, a profondément changé. La révision de la taxonomie du genre Aspergillus enregistre ainsi la dénomination « section » qui s’interpose entre le genre et l’espèce ; par exemple, Aspergillus fumigatus sensu lato est reconnu comme représentant la section Fumigati, incluant 35 espèces dont A. fumigatus sensu stricto [6-8]. Scedosporium/Pseudallescheria, considérée autrefois comme une seule espèce, est en réalité un complexe d’espèces incluant cinq espèces – S. apiospermum sensu stricto, P. boydii sensus stricto, Pseudallescheria minutispora, S. dehoogii, S. aurantiacum – responsables d’infections chez l’homme [9, 10]. Au sein des complexes d’espèces, les spectres de sensibilité des espèces sensu stricto peuvent être très différents. Les conséquences d’une identification précise de l’espèce sont donc importantes pour la mise en place précoce d’un traitement antifongique adapté, dont le choix repose essentiellement sur les seules données de l’espèce identifiée.

Dans ce contexte, de nouvelles exigences apparaissent afin d’atteindre un niveau d’identification des champignons filamenteux suffisamment fiable et rapide. Il faut donc reconsidérer les méthodes actuellement disponibles dans les laboratoires de mycologie. Le recours à la biologie moléculaire est une alternative de plus en plus utilisée afin d’affiner le diagnostic d’espèce et parfois même représente la seule possibilité d’identification lorsque la culture fongique n’apparaît que sous forme d’un mycélium « stérile », c’est-à-dire sans fructification permettant une orientation sur des critères morphologiques. Ces techniques sont basées sur l’amplification, directement à partir de la colonie, de régions d’ADN présentes chez tous les champignons et dont les séquences sont suffisamment différentes entre espèces pour permettre de les identifier précisément. Les méthodes d’identification utilisées pour déterminer l’espèce, comportent soit le séquençage du fragment amplifié et la comparaison avec les séquences disponibles dans les banques de données, soit l’analyse du polymorphisme de la taille des produits d’amplification de régions spécifiques [11]. L’identification moléculaire est donc une technique longue et relativement coûteuse, non utilisable en routine et actuellement réservée à des situations particulières.

La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF MS (Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization – Time Of Flight – Mass Spectrometry), qui permet un niveau très important de différenciation des espèces bactériennes et des levures, est une méthode intéressante pour combler le manque actuel de méthodes rapides et précises d’identification des champignons filamenteux. La complexité de la taxonomie des champignons filamenteux, associée à la diversité de plus en plus large des espèces fongiques responsables d’infections opportunistes, constituent donc un défi important pour l’élaboration de bases de données fiables pour une application en routine du MALDITOF MS.

 

IDENTIFICATION DES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX PAR SPECTROMÉTRIE DE MASSE

L’identification des champignons filamenteux par MALDI-TOF est un champ d’innovation en pleine expansion. En effet, les seules données actuellement disponibles sont extrêmement récentes et proviennent de quelques équipes qui ont développé des bases de données ciblant spécifiquement l’identification de certains champignons filamenteux et les ont validées sur un panel d’isolats cliniques encore restreint [12-20]. Ainsi, contrairement aux nombreuses études disponibles sur l’évaluation comparative des performances de l’identification des espèces bactériennes et de levures par spectrométrie de masse MALDITOF et par méthodes conventionnelles, on ne dispose actuellement que de très peu de données sur l’utilisation de la spectrométrie de masse pour l’identification en routine des champignons filamenteux dans les laboratoires. Ceci est probablement dû, en partie, au manque de base de données pour l’identification des champignons filamenteux dans les premiers systèmes commercialisés [21]. Actuellement, ces bases tendent à se développer et la suite de ce document expose l’état des lieux des données disponibles.

1. Méthodes proposées et choix des espèces
Deux systèmes d’identification ont été utilisés pour l’identification des moisissures, l’un utilise la fonctionnalité de création de base « maison » du logiciel Biotyper® de la société Bruker Daltonics (Bremen, Allemagne), l’autre la technique développée par Andromas® (Paris, France). Des bases de données ont été développées pour l’identification des moisissures les plus fréquemment isolées en clinique. Elles concernent actuellement l’identification des Aspergillus spp., des Scedosporium spp., des Fusarium spp. et des mucorales. La spectrométrie de masse a également été appliquée à l’identification des dermatophytes. Seules trois équipes, utilisant trois systèmes d’identification différents, incluant la fonctionnalité des systèmes Biotyper®, Saramis® et la technique Andromas®, ont développé des bases de données pour ces champignons. Les stratégies de construction des bases ainsi que le choix des espèces à y inclure varient en fonction des auteurs. Les paramètres déterminant la qualité du spectre incluent la méthode de préparation de l’échantillon à analyser, la nature de la matrice et la maturité de la culture. La stratégie d’interprétation est différente en fonction des systèmes développés par les différentes sociétés (cf. chapitre de Marinach-Patrice de ce numéro spécial).

Une étude réalisée par Coulibaly et al. montre que la maturité des colonies, c’est-à-dire l’âge de la culture, est un élément essentiel pour la détermination de spectres de référence reproductibles [17]. En effet, le spectre s’enrichit avec l’âge de la culture. Ainsi, certaines équipes ont intégré dans leur base de données plusieurs spectres de référence par espèce, correspondant à des spectres obtenus à partir de cultures jeunes dans lesquelles la sporulation est débutante et de cultures plus âgées dans lesquelles les spores sont abondantes [13, 14, 20]. La figure 1 qui montre l’aspect de deux spectres issus de colonies âgées de trois et sept jours d’une même culture d’une souche de Scedosporium aurantiacum illustre l’importance de la prise en compte de ce paramètre pour permettre l’obtention d’un système d’identification indépendant de l’âge de la culture du champignons filamenteux testé.

2. Base de données
Deux équipes ont développé des bases de données pour l’identification des espèces d’Aspergillus. Les résultats de ces deux équipes sont convergents et montrent que la spectrométrie de masse est un outil performant et fiable pour l’identification des Aspergillus (Tableau I). En effet, cette technique a permis d’identifier au niveau de l’espèce les isolats cliniques testés avec un pourcentage élevé de bonne identification, respectivement de 98,6 % et 96,2 % (13, 14). Il en est de même pour les espèces du complexe Scedosporium / Pseudallescheria et les principales espèces pathogènes de Fusarium pour lesquelles le MALDI-TOF permet, dans tous les cas, une identification précise des espèces présentes dans les bases développées par chaque équipe [14,15,20].

Ces résultats, obtenus sur un nombre important de souches, montre que le MALDI-TOF est capable de différencier précisément les espèces au sein des sections et des complexes d’espèces. Cette technique permet donc d’atteindre des performances comparables à celles obtenues par identification moléculaire qui nécessite le séquençage de plusieurs loci spécifiques à chaque groupe de champignons filamenteux pour atteindre un tel niveau de discrimination. L’identification des dermatophytes par spectrométrie de masse a été étudiée par trois équipes travaillant avec trois systèmes différents [12, 18, 19]. Des résultats non équivalents ont été obtenus dans les deux études qui ont analysés un nombre important d’isolats cliniques [12, 19].

En effet, dans l’étude de Theel et al. dans laquelle une base de donnée a été développée en utilisant la fonctionnalité du système Biotyper®3, l’identification au niveau du genre a été obtenue pour 93 % des isolats testés ; toutefois, l’identification précise de l’espèce n’a été possible que pour 59 % des isolats. Ces résultats contrastent avec ceux obtenus par Alshawa et al. qui, en utilisant le système Andromas®, identifient au niveau de l’espèce 97 % des isolats testés. Il est probable que cette différence soit le reflet des stratégies utilisées pour l’analyse des souches qui, dans le cas de l’étude de Theel et al., ne prennent pas en compte la maturation de la colonie. En effet, dans cette étude, les spectres de référence ont été obtenus à partir de cultures de trois jours, alors que les souches cliniques ont été testées à partir de cultures d’âges différentes.

Dans l’étude d’Alshawa et al., les isolats cliniques ont été testés à partir de cultures de même âge qui correspondaient à la maturité choisie lors de la construction des spectres de référence. Il est possible que la maturité des colonies de dermatophytes, à l’instar de ce qui a été démontré pour les moisissures, soit un paramètre essentiel pour l’identification des isolats au niveau de l’espèce.

 

CONCLUSIONS

La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF-MS apparaît être un outil extrêmement puissant pour l’identification des champignons filamenteux. Bien que très peu d’études soient disponibles, leurs résultats montrent d’emblée l’extrême pertinence de cet outil pour l’identification des moisissures et des dermatophytes. Il manque cependant, à l’heure actuelle, une réelle évaluation des pertinences de cet outil, testé dans des conditions d’utilisation en routine au laboratoire. De plus, la plupart des bases de données permettant l’identification des champignons filamenteux ont été développées par différentes équipes et ne sont pas encore intégrées dans des systèmes d’identification commercialisés, ce qui représente une limite importante à leur diffusion. Actuellement, seule la base de données Andromas® contient les spectres de référence pour l’identification des espèces d’Aspergillus, de Scedosporium et des dermatophytes. Enfin, ces bases de données doivent être complétées afin d’élargir à un plus large panel d’espèces l’identification des champignons filamenteux susceptibles d’être isolés chez les patients immunodéprimés.

 

/ + / Références

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